[의약바이오 취업 캠프] - Day3
3일 차 실습수업이자 이번 주의 마지막 수업이었다.
<오늘의 교육>
1. 어제 Cell 배양한 거 현미경으로 확인 – 배양이 잘 되는 중이다. 7-80% 정도 찬 것 같다.
2. HPLC – 어제 실시한 크로마토그램 확인, 데이터로 그래프 그리기
Postrun analysis program으로부터 텍스트 파일을 export 하여 저장하고, 엑셀로 옮긴 후 차트로 나타내었다.
1. HPLC software에서 실행 결과인 텍스트 파일을 export 하고, 저장한다.
2. 엑셀을 실행하고, 한쪽에 날짜, 분석물질, 파장, 용매 등의 기본 정보를 적어놓는다.
3. 엑셀에서 [파일] - [열기] 에서 다운받은 텍스트 파일을 연다.(마법사 뜨는 거 다 마침 누른다.)
4. 여러 개의 시트가 열리는데 각각의 시트에서 LC chromatogram이라는 부분을 찾아서 R.Time (min)과 intensity 부분을 전부 지정해서 복붙한다. (여기서는 아데닌의 chromatogram이다.)
5. 나머지 카페인과 커피 샘플의 intensity정보를 모두 복붙하여 정리한다.
6. R.time(min)부터 커피의 intensity까지 모두 지정하고, [삽입] - [차트] - [곡선이 있는 분산형] - [차트 이동] - [새 시트로 이동] 한다.
7. 차트의 눈금선, 가로/세로 축, 축의 최솟값, 표시 형식에서 범주를 숫자로 지정하는 등의 방법으로 편집한다.
8. 차트를 복사해서 [데이터 선택] - 커피를 지운다. 그리고 그래프가 농도 의존적인지 확인한다.
아닌 경우, 보통은 2가지의 이유이다.
1) 샘플을 잘못 만든 경우
2) solvent 비율이 잘못된 경우 -> peak 크기가 농도 의존적이 아니게 나올 수 있다.
9. 확인했다면, 8의 차트에서 같은 방법으로 아데닌을 지우고 카페인 peak를 토대로 검정 곡선을 구하고, 그를 통해 커피에 포함된 카페인의 함량을 계산한다.
보통 높이와 면적으로 구하는 두 가지 방법이 있지만, 오늘은 높이로 구했다.
검정 곡선 구하는 방법은 다음과 같다.
1) 카페인(25γM)의 제일 밑에 MAX 함수를 삽입해 가장 높은 intensity(높이)를 구한다.
2) 다른 농도의 카페인도 같은 방법으로 구한다.
만약, 최고 피크가 다른 영역에 존재할 경우, 다른 범위의 R.time에서 따로 지정하여 MAX 값을 구해야 한다.
3) 저 네모칸을 그대로 지정해서 [삽입] - [차트] - [분산형] - [차트 이동] - [새 시트로 이동] 한다.
4) 여기에 [차트 요소] - [추세선] - [추세선 서식] (수식을 차트에 표시, R-제곱 값을 차트에 표시 켜기)의 편집을 한다.
5) 수식 복붙 해서에 x관한 식으로 바꾸고, y에 대입해서 농도를 계산한다.
6) 단위를 맞춰서 카페인 농도와 퍼센트를 계산한다.
결과
이번 실험은 결론부터 말하자면, 데이터가 좋지 못하게 나왔다.
1) 그래프의 peak들이 지저분하다. 이유는 원래 isocratic으로 진행하는 실험이었는데, 조교님께서 software에서 설정을 잘못해서 시간에 따라 solvent들의 기울기가 적용되었기 때문이다.
2) 우리 조는 커피 샘플의 intensity는 다른 조와 비슷했지만, 각 농도의 카페인 intensity가 현저하게 적어, 검정 곡선을 통한 카페인의 농도 추정에서 농도가 엄청 높게 나와버렸다. (카페인 sample을 만들 때 충분히 녹이지 못한 것 같다.) 49.8%가 나왔는데 원래는 4.2%가 정상이라고 한다...
HPLC는 망하면 사람 탓이라는데, 참 정직해서 좋은 것 같다. 망해도 지금 망하는 게 나으니 좋은 경험을 했다고 생각한다. 다음 주부터는 본격적으로 HPLC를 다루는데 같은 실수를 반복하지 말아야겠다.
3. 특이사항 - 프로젝트 (D.W. 추출물 필터링하기)
어제, 맑은 층만 주사기로 뽑아서 필터링하자던 계획은 물거품이 되었다. 맑은 층이 전혀 맑지 않았기 때문이다...
문득, 작은 양으로 촘촘한 필터에 거르는 게 아니어도 한꺼번에 대충이라도 부유물들을 거르고 pump를 이용한 paper filtering을 다시 하면 되지 않을까 생각했다. 교수님께 거름망 같은 게 있냐고 여쭤보니 마침 있다고 하셨다. 그래서 두부 만들 때 쓰는 삼베 천 같은 거름망 백에 추출물을 걸렀다. 결과는 놀라웠다. paper filtering이 됐다! 그래서 많은 양의 추출물 sample을 얻었고, 다음 주에 정상적으로 HPLC를 진행할 수 있게 되었다. 참 우여곡절이 많았지만 역시 어떻게든 방법은 있는 것 같다.
4. subculter(Raw 264.7 cell, #17, 1/5)
잘 자란 cell을 이사시켜 주었다.
5. Cell seeding 이론교육 - 다음 주에 있을 실습에 대해 미리 설명하셨다.
목적: 세포 독성 실험을 위해, 세포 수 파악 후 원하는 양의 세포를 plate에 심기
필요한 것: Trypan blue (상태 안 좋은 애들은 파란색으로 물들이고, 카운트 제외), Hemocytometer (눈금이 있어 세포 수를 셀 수 있음, 96 well plate(1개의 Well(100ul)에 5X10^3로 분주, 11번까지만 사용)
자세한 방법도 배웠지만, 분량을 조절해야 하기에 오늘은 이만 줄이겠다.
<소감>
오늘은 점심시간도 널널하고, 수업이 진짜 일찍 끝났다. 하지만 이번 교육에서 이런 날은 오늘이 마지막이라는 교수님의 말씀이 너무 무서웠다... ㅋㅋㅋ 조금은 빠듯한 교육이지만, 하루에 하나 이상씩을 배워가는 느낌이라 성취감이 있고 뿌듯하다. 보다 많은 것을 내 것으로 소화하면서 앞으로의 시간들을 의미 있게 보내야겠다.