[의약바이오 취업 캠프] - Day4
실습 2주차가 시작되었다.
<오늘의 교육>
1. HPLC - 2조 추출물 지표물질 함량 확인
다음의 조건으로 HPLC를 작동시켰다.
1. 전개액(1% acetic acid in D.W.과 1% acetic acid in ACN)을 만들어 sonication해서 준비한다.
2. standard인 geniposide sample을 x100, x200, x400배 희석해 10㎍/ml, 5㎍/ml 2.5㎍/ml으로 농도를 맞춘다.
3. 추출물 sample(D.W.와 에탄올 추출물)을 에탄올로 각각 x1000, x2000배 희석한다.
4. 2,3의 결과물들을 10㎕씩 HPLC vial에 옮겨준다.
5. HPLC 기기의 펌프 관을 닦고 1에서 만든 solvent로 교체한다.(선을 손으로 잡으면 안되고, 선이 solvent의 바닥에 닿아야 한다.)
6. column을 교체해준다. (뒤집에서 열고 끼운다음 다시 뒤집기)
5. 유속, 온도, 기울기 용리, 파장 등의 조건을 설정한다. (시간에 따른 기울기가 다르기 때문에 1cycle이 끝날 때 초기 농도로 맞춰주고, 안정화 되는 시간을 추가해줘야한다.)
6. Batch를 설정한다.
7. 30분의 안정화 시간을 가진 후, HPLC를 작동시킨다.
2. Cell seeding - MTT를 위한 cell을 seeding
96 well plate에 지표물질과 천연물 2개를 각각 test한다.
목표 농도는 5x10^3 cell/well = 5x10^4 cell/ml이다 => M’
사용할 양은 각 well 당 100㎕이고, 12*11=132개의 well을 사용하므로 13.2ml 필요하지만 넉넉하게 16ml로 잡았다. => V’
현재 cell의 농도와 얼마를 사용할 지 정하기 위해 MV=M’V’식을 이용한다.
1. 어제 subculture한 세포를 가져와서 배지를 suction한다.
2. DPBS를 이용하여 washing한다.
3. 배지를 넣고 scrapper로 긁어준다.
4. pipeting하면서 cell을 풀어주고, 15ml 튜브에 모은다.
5. 3000rpm 3분 원심분리한다.
6. 상층액을 제거하고, 배지 4ml를 넣어 resuspension한다.
7. 6의 결과물을 15㎕를 etube에 넣고, trypan blue 15㎕을 넣어 섞어준다.
8. 7의 결과물을 Hemocytometer에 넣고 cell을 센다 => M 구하기
9. 구한 M을 토대로 V를 계산한다. (=100㎕)
10. 6의 결과물을 pipeting하여 잘 풀고, 100㎕를 50ml tube에 넣고, 배지 15.9ml과 섞는다.
11. 10의 결과물을 petri dish에 옮기고, 96well plate에 multi pipet을 이용해 pipeting한다.
12. 배양 plate에 새 배지 10ml를 넣고 6의 결과물을 잘 풀어서 500㎕ 넣는다.(maintain 용도)
13. 배양기에 보관한다.
특이사항 - cell counting을 할 때, 터치로 숫자를 세는 어플을 사용해서 쉽게 셀 수 있었다. 그런데 cell이 너무 많아서 6과정에서 원래는 2ml 넣어주는데 나는4ml를 넣었다.
<소감>
그래도 한 번 해봤다고 HPLC 준비를 할 때 비교적 수월하게 진행할 수 있었다. 솔직히 전날 과음도 하고 잠을 못자서 오전에는 정신 상태가 아주 불량했었다. 하지만 이렇게 적어놓으면서 복기할 수 있어 참 다행이다. 내일부턴 제대로 된 정신으로 교육을 들어야겠다.