[의약바이오 취업 캠프] - Day2(2)

말로만, 책으로만 보고 듣던 HPLC라는 녀석을 직접 본 날이다.

3. HPLC 교육 및 실습 - 아데닌과 카페인 분리하기 대작전

(1) 시약과 샘플 준비하기 - 전개액(D.W.: 메탄올 = 6: 4), 3mM 아데닌(100ml), 50mM 카페인(100ml), 커피 용액(50mg/ml)

방법
1) D.W. 600ml, 메탄올 400ml 정량해서 플라스크에 1L 전개액을 만든다.
2) 아데닌 3mM 용액을 전개액을 사용해 30γM 농도로 희석한다.
> 100배 희석 [전개액 (1ml-10γl) + 아데닌 3mM 용액(10γl)]
3) 카페인 50mM 용액을 전개액을 사용해 25, 50, 100γM 농도로 희석한다.
> 500배 희석 [전개액 (10ml-20γl) + 카페인 50mM 용액(20γl)] 후 2 fold dilution
4) 커피 용액(50mg/ml)을 전개액을 사용해 (50γg/ml)의 농도로 희석 후, 0.45γm syringe filtering.
> 100배 희석 [전개액 (1ml-10γl) + 커피 용액(50mg/ml) 용액(10γl)]
각각의 용액을 100 γl씩 HPLC vial에 옮긴다.

(2) HPLC 작동 - 각 용약을 HPLC를 이용하여, 크로마토그램 데이터를 얻은 후, 260nm 카페인 용액의 결과를 검정 곡선을 사용하여 커피에 들어있는 카페인을 정량한다.

HPLC 준비 - HPLC는 작동 전 크게 4개 부분(solvent, sample, software, batch)을 준비해야 한다.
solvent(전개액): 펌프의 압력으로 column을 이동하며 시료를 이동시키고, 분리한다. solvent를 degassing하는 과정이 필요하다. pump로 가는 길목에 degassing하는 장치가 있다. 이 외에도 실험실 마다 따로 흔들어서 가스를 빼거나, sonication을 사전에 한다고 한다.
sample: 분석 대상인 시료와 standard이다. 주의할 점은 HPLC vial의 뚜껑을 만지지 않는 것과 트레이에 넣기 전 손가락으로 쳐서 공기를 빼주는 것이다. (그래야 온전히 같은 양의 sample을 기계가 취할 수 있다.)
software: 다음 사진에 나온 내용들을 조작 가능하다.

HPLC software에서 조작할 수 있는 것들.

batch: 다음 사진에 나온 엑셀 같은 batch table에서 vial number, tray name, sample name 등 실행 순서(sequence)를 설정할 수 있다.

batch table 조작하기

우리는 C18 column을 사용했다. solvent는 1종류 이므로 isocratic이고, 260nm(카페인)를 관찰할 것이다.
column oven 온도와 유속 등의 조건은 절대적인 건 아니고, 환경과 상황에 따라 유동적일 수 있다고 조교님께서 알려주셨다.
HPLC를 작동하자 기계가 sequence에 맞게 vial을 가져다가 시료를 주입했다(마치 과자 자판기같이 일사분란하게 움직였다.) 내일 HPLC가 일을 다 끝내 놓으면 데이터를 볼 수 있을 것 같다.

<소감>
오늘은 전에는 해보지 않았던 것들을 배우고, 직접 해봐서 그런지 에너지 소모가 상당했다. 9-6로 쉬는 시간도 거의 없이 진행되어서 피로도도 상당했다. 숙소에서 샤워하고 나도 모르게 잠들어 버렸다...
HPLC 교육에서는 위의 내용 외에도 solvent 교체하기, column 교체하기(공기가 안 들어가게 거꾸로 교체), auto purge하기 등 많은 것을 알려주셨지만 솔직히 첫 시간에 다 소화하기는 무리였다... 교수님께서 앞으로도 이 친구를 수없이 경험하면서 본인보다 전문가가 될 수 있다고 하니 차차 알아가면 될 것 같다. HPLC 기기는 자동차 같은 거라고 조교님이 말씀하셨다. 그 말을 듣고 '나는 이제 주행연습 중인데 고속도로를 타려하는 건 욕심이다'라는 생각이 들었다. 단계적으로 차근차근 이해하며 HPLC와 친해져야겠다.