[의약바이오 취업캠프] - Day12

<오늘의 교육>

 

1. HPLC 실습 - 아세트아미노펜 정량

지난 시간에 TLC, spectrophotometer에 이은 아세트아미노펜 검출로 이번엔 HPLC를 이용했다.

 

이동상은 D.W. : 메탄올 = 3 : 1 용액을 사용했다.

검액으로는 각 조마다 아세트아미노펜을 standard로 2.5, 5, 10㎍/ml의 농도로 만들고,

펜잘 큐, 타이레놀, 타나센 정은 각 10㎍/ml의 농도로 이동상에 녹여 준비했다.

이후 1.5ml/min의 유속으로 진행하며 243nm에서 관찰했다.

 

2. DPPH assay

DPPH assay는 항산화능 즉, 활성산소(free radical)를 얼마나 제거할 수 있는지 측정하기 위해 수행한다.

활성산소는 몸속의 산소가 산화과정에 이용되어 여러 대사과정에서 생성된다. 활성산소는 생체조직을 공격하고, 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소이다.

DPPH radical은 보라색을 띤다. 이것이 항산화제(시료)와 반응하면 노란색으로 색이 변한다. 이를 흡광도로 측정하여 항산화능을 측정한다.

비교를 위하여 항산화제인 ascrobic acid를 사용한다.

 

실험 방법

1. 96well plate에 EtOH을 A2-A11까지 50㎕씩 넣는다.(4번째 열까지 넣는다.)

2. A1에 측정하고자 하는 시료 100㎕를 넣고, A10까지 50㎕씩 2-fold dilution 한다. A11은 대조군으로 사용한다.

3. 다른 96well plate에 EtOH을 A2-A11까지 50㎕씩 넣는다.(4번째 열까지 넣는다.)

4. 대조군인 Ascrobic acid(1mg/ml)를 100㎕를 넣고, A10까지 50㎕씩 2-fold dilution 한다.

5. 두 개의  96well plate에 A1-A11 well에 DPPH(0.5mM EtOH에 녹임)를 50㎕씩 넣어 1개의 well 당 총 volume이 100㎕이 되게 한다.

6. plate를 포일로 감싼 후 37℃, 30분 반응시킨다.

7. ELISA Reader를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정한다.

그림과 같이 처리한다.

결과 분석

1) raw 데이터 정리

2) - blank 구하기

EtOH 100㎕를 blank로 잡고 이를 뺀 흡광도를 구한다.

3) /control * 100

4) control - 각 sample 값

위의 3)의 값들은 보라색 기준 detection 값이다. 그래서 control이 100으로 나온다.

우리는 노란색의 흡광도를 검출해야 하므로 control에서 각 sample 값을 빼준 값을 구한다.

그리고 이를 그래프로 나타낸다.

5) 결과 해석

DPPH assay 그래프

IC 50 값을 비교해서 항산화능을 비교한다. scavenging activity 50% 전 후 두 지점의 평균 농도를 구해 IC50값으로 사용한다.

IC 50은 50%의 항산화능을 가질 때의 각 물질의 농도이다. 그래프를 보면 D.W. 와 EtOH 추출물 모두 대조군인 Ascrobic acid보다 IC 50 값이 작다. 따라서 그래프를 보면 항산화능을 갖는 것처럼 보인다.

 

하지만, 지표물질인 geniposide가 항산화능을 갖지 않는다는 결과가 나왔다. 또한 치자 추출물의 노란색이 흡광도 측정에 영향을 주었을 가능성도 배제할 수 없다. 따라서 치자 추출물의 색이 영향을 주지 않는 희석배수에서 다시 DPPH assay를 실시하기로 했다.